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Chromatographie sur colonne



chromatographie (du grec χρῶμα, translittéré en khrôma, «couleur»), est une technique de séparation des composants d'un mélange homogène basé sur la répartition de ses composants entre deux phases, l'une stationnaire et l'autre se déplaçant selon une direction définie. Danschromatographie sur colonnela direction va de haut en bas et est dictée par un tube de verre (la colonne).

chromatographie sur colonne est une technique chromatographique particulière qui est basée sur la propriété que certaines substances ont, une fois dissoutes dans des solutions appropriées, d'interagir avec une matrice solide convenablement préparée. Je vais essayer de mieux expliquer ce que cela signifie ce que je viens d'écrire!

Chromatographie sur colonne: qu'est-ce que c'est

Ce n'est rien de plus qu'une méthode de séparation chromatographique qui a lieu dans une colonne de verre. Cette technique exploite la différence de charge, de taille, d'affinité de liaison ou d'autres propriétés du composant à isoler pour créer des bandes avec des caractéristiques différentes.

Dans les photos de cette page, nous vous montrons les séquences duchromatographie sur colonneet en particulier l'extraction de l'éluat, c'est-à-dire la substance «partiellement purifiée» qui sort du bec terminal de la colonne de verre.

chromatographie sur colonneil est très utile pour la purification de protéines et pour la séparation d'un grand nombre de substances à examiner individuellement. Parfois, des substances isolées avecchromatographie sur colonne ils perdent les propriétés qu'ils avaient à l'intérieur du mélange. Tout dépend de la technique dechromatographie sur colonneet de la substance que vous souhaitez purifier.

Chromatographie sur colonne: comment ça marche

Un tube en verre est rempli d'un matériau solide poreux, défini comme "état stationnaire". La phase stationnaire a des propriétés chimiques appropriées choisies sur la base de la substance à purifier / séparer du mélange. La colonne est ensuite remplie d'une solution tampon, également formulée de manière appropriée. La solution tampon s'appelle "phase mobile”Et contient le mélange que vous souhaitez séparer.

Le mélange à séparer est dissous dansphase mobile. La phase mobile vient alorsen couchesau sommet de lacolonneet percolé à travers leétat stationnaire(la matrice solide). De cette manière, la solution se diffuse le long ducolonneet forme une bande continue sur toute la phase stationnaire. Les substances qui éluent (quittent) la colonne ont des propriétés spécifiques basées sur l'ordre d'évitement.

Pour mieux comprendre, prenons l'exemple de la purification des protéines, même si la phase mobile peut être représentée par n'importe quel mélange. Nous ferons éluer les protéines individuelles du colonne plus ou moins rapidement selon leurs propriétés.

En fonction du type de phase stationnaire, nous avons différentes techniques dechromatographie sur colonne, Lequel:

  • Chromatographie d'échange d'ions
  • Chromatographie d'exclusion moléculaire
  • Chromatographie d'affinité

Il existe également une technique plus coûteuse qui utilise la haute pression, à savoir lechromatographie liquide haute pressionou HPLC.

Chromatographie d'échange d'ions

Dans chromatographie d'échange d'ionsla matrice solide (phase stationnaire) est riche en charges positives ou négatives. Il va sans dire que lechromatographie d'échange d'ionstire parti des différences de type et d'intensité decharge électrique netteà un certain pH.

Dans ce cas, leétat stationnaireest un polymère synthétique (résine) contenant des groupes chargés négativement (on parle donc deéchangeurs de cations) ou des groupes chargés positivement (on parle decroûtes anioniques).

Revenant à l'exemple de la purification des protéines, la différence de charge est liée à la présence d'acides aminés avec certains groupes fonctionnels. L'affinité de chaque protéine pour les groupes chargés decolonneil dépend du pH qui à son tour affecte l'état d'ionisation des groupes fonctionnels des acides aminés constitutifs.

Danschromatographie sur colonnela solution de préparation de la phase mobile est critique. Dans notre exemple avec les protéines, la concentration en sel et le pH peuvent créer un gradient qui peut favoriser l'extrusion de certaines protéines.

Chromatographie ionique: échange de cations

Dans le cas du chromatographie ioniqueavec la matrice d'échange de cations, la matrice solide a des groupes chargés négativement de sorte que les protéines avec une charge positive nette seront les dernières à sortir de la colonne. Les premiers composés à sortir de lacolonnece seront ceux avec une forte charge nette négative (par répulsion de la matrice), puis des substances avec une charge partiellement négative sortiront. Les substances à éluer se déplaceront à travers lecolonneavec une vitesse dépendant de leur charge nette dans la solution utilisée.

Chromatographie d'exclusion moléculaire

Dans ce cas, le mélange (phase mobile) est ajouté en uncolonnecontenant unpolymèreavec des réticulations et des molécules deisolerils seront séparés par taille. On pense instinctivement que les plus petites molécules sortiront les premières de la colonne, mais en réalité c'est exactement le contraire.

Les plus grosses molécules seront obligées de parcourir le chemin le plus court jusqu'à la fin de la colonne. Par diffusion, les molécules plus petites seront libres de pénétrer dans les pores de la matrice solide, ce qui prendra plus de temps à éluer. Le premier éluat collecté sera celui contenant les plus grosses molécules.

Chromatographie sur colonne d'affinité

Un ligand est présent en phase stationnaire. Lorsque la solution à séparer traverse la colonne, les molécules qui ont une affinité pour ce ligand formeront une liaison spécifique. Les substances d'intérêt seront retenues dans la première ou la dernière fractions collectées selon le type de ligand utilisé.

Chromatographie liquide haute pression

Les techniques dechromatographie sur colonnejuste décrit peut avoir une résolution discrète des bandes. La raison? Chaque substance a tendance à se diffuser après un certain temps.

En utilisant des pompes haute pression, la vitesse augmente et le temps nécessaire aux molécules pour parcourir la colonne diminue. Dans ce contexte, des matrices chromatographiques capables de résister à de fortes pressions sont nécessaires.

En réduisant le temps de transit dans la colonne, lechromatographie liquide haute pression(HPLC) limite l'étalement des bandes et améliore grandement la résolution de l'éluat collecté.


Vidéo: La Chromatographie -- Episode 3-- Le modèle des plateaux théoriques-- En Darija (Septembre 2021).